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  • 组织裂解液和细胞裂解液如何配置

    详细介绍:     组织裂解液和细胞裂解液如何配置?    细胞裂解液的配置    方法一 、试剂准备    1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液: 150 mM NaCL 1% NP-40 (去垢剂) 0.1% SDS (去垢剂)    2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入) 2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入) 1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂) 1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂)    1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选)    以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。    2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF 1.5 mM EDTA    1mM NaVanadate (钒酸钠)(任选)    3、对数期生长状态佳的细胞,75cm至少3-4瓶(90%以上生长面积)。    二、实验步骤    1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上, 用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的 PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面,以洗去瓶中残留的培养基,倒掉PBS ,重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS,尽量在冰上操作。 2、 向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞,如果所需要刮的同种细胞有多瓶,则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (由于处理后的细胞裂解液较粘稠,所以宜用直径大点的吸液管吸取)。    3、 吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中 (置于冰上),然后重复步骤2    以刮取剩下的细胞。    4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中,样品插入冰盒进行超声,超声强度以不产生泡沫为准,超声每次2-3秒,重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀,应离心10000rpm,10分钟,留取上清。    5、 取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度(用Biorad Bradford raybet雷竞技下载地址或紫外分光光度计,在A280测定),分装保存在 -70℃。    方法二    NP-40 or Triton-100 1% TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/L NaCl 150mmol/L    PMSF(苯甲基磺酰氟) 0.1mmol/L(100µg/ml) Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 µmol/L(0.7µg/ml) Leupeptin(亮抑制肽) 0.5mg/ml    Aprotinin(抑蛋白酶肽) 0.3µmol/L(1µg/ml)    (注:PMSF 贮存液:100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中; Aprotinin 贮存液:10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0); Leupeptin 贮存液:10mg/ml溶于水中;    Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存) 裂解操作程序:    * 离心收集1×107 个细胞    * 加入4℃预冷1%NP-40裂解液100µl    * 剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀(如为组织进行匀浆) * 4℃放置15~30min    * 4℃离心,15 000rpm,10min,取上清备用。    方法三    细胞裂解液的主要目的:1.利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;2. 溶解蛋白;3. 蛋白变性使其稳定;4. 抑制蛋白酶活性 推荐RIPA buffer:    . 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系 · 150 mM NaCl 等渗体系    · 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂 · 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂    · 5 µg/ml Aprotinin (抑肽酶)蛋白酶抑制剂 · 5 µg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂 · 1% Triton x-100 破坏细胞    ·1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂    细胞裂解液的主要目的:1.利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;2. 溶解蛋白;3. 蛋白变性使其稳定;4. 抑制蛋白酶活性 推荐RIPA buffer:    . 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系 · 150 mM NaCl 等渗体系    · 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂 · 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂 · 5 µg/ml Aprotinin 蛋白酶抑制剂 · 5 µg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂 · 1% Triton x-100 破坏细胞    ·1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂 ·0.1% SDS 强变性剂和蛋白溶解剂    其中PMSF等蛋白酶抑制剂最好另外配制,-20℃保存,用前混合。蛋白酶抑制剂较贵,如果你的经费有限,可以仅用PMSF试一试,能出结果就可以。      用于普通的 Western、IP或co-IP,我们推荐使用Western及IP细胞裂解液(P0013),该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用,用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后,没有非常粘滞的透明状DNA团块形成,不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。对于某些特殊蛋白的IP,如果发现Western及IP细胞裂解液(P0013)效果不是非常理想,可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40 裂解液。如果发现IP的时候背景很高,即非特异的蛋白也被IP下来,则需要选用裂解强度较高的裂解液,例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来,则说明裂解液的强度过强,可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。对于某些难溶解蛋白的Western,如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想,可以尝试使用裂解强度更高的裂解液,例如RIPA裂解液(强、中)或 SDS裂解液。


  • 关于封闭液的使用方法

    详细介绍:     关于封闭液的使用方法    A、请问在进行免疫荧光的实验时,浸一抗之前,要用的封闭液中1%的是怎么配制? 封闭液封闭后还用PBS清洗干净再浸一抗吗?    可以直接用0.02M的PBS配制;不用PBS清洗干净,直接浸一抗。    B、间接法中我想摸索封闭液的最佳浓度,用抗原包被后,用不同浓度的(0.5%,1%,2%,3%)封闭,其他条件固定,测得 OD450nm后,可以看出随着浓度增高,空白值降低,待测样品的OD450nm值也降低,,应该如何确定的最佳浓度?    Q1、你的浓度是否太高?最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的,封闭是否必要,取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA 固相均需封闭,封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来,双抗体夹心法,只要酶标记物是高活性的,操作时洗涤彻底,不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被,因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面,业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中,封闭一般是不可少的    Q2、判断封闭条件,要考虑在此条件下是否能达到试验要求,即棋盘滴定要满足:阳性样品OD=0.8、阴性样品OD<=0.1,而不是看你待测样品OD变化趋势;    过低封闭浓度势必造成本底过高,但过高又会使灵敏度降低,因此只要选择能够满足你试验要求的最低浓度就可以了。    另外提醒,洗涤一定要彻底,很重要的。    Q3、包被后封闭前一般要洗涤一遍,以便于洗掉结合不牢固的包被物,防止在实验中影响实验结果;封闭后一定不要洗涤,封闭的目的就是要靠蛋白填补未被包被物占领的空间,另外封闭液一般也具有保护作用。     C、新生牛血清(细胞培养时候加到1640的那一种)可以么,用多大的浓度配比较好啊,是用双蒸水配吗??    Q1、5%,TBS配,是牛血清蛋白,粉剂,不是牛血清哦    Q2、如果不是用biotin-avidin系统的话,用5%脱脂奶粉做封闭液就可以了,廉价,效果也很好。    Q3、封闭液一般是用5%的或者是用5%的脱脂奶粉,溶剂一般使用TBST。做实验的时候,我一直强调这样的一个原理,那就是在了解原理的基础之上,我们完全可以不拘泥于书本,进行创造。就拿这个封闭液来讲,要是单纯的一种封闭效果仍然不好的话,我们完全可以两种合用,我就试过1%的和5%的脱脂奶粉合用进行封闭的事例。所以,搞科学研究是需要我们进行再创造的。      D、交联抗原注射到兔子体内得到一抗,我们Elisa的二抗用的是羊抗兔HRP标记的二抗。请问,在封闭时,用什么样的封闭液比较好呢?是无蛋白封闭液,还是羊的免疫前血清?    Q1、用5%的脱脂奶粉就可以吧,溶到PBS里,加0.1%的吐温-20.      E、以前买的是专门的一抗稀释液,现在用完了,想换液做封闭液用,因为牛奶太容易坏了,请问可以长期保存么,5%是否可以?    Q1、5%配完放冰箱就是了,不过还是有点贵,脱脂奶粉挺好的,现用现配。    Q2、确实有点贵,我们在牛奶中加千分之0.2的叠氮钠,放4度可保存2月左右。    Q3、NaN3对HRP是强烈抑制剂,如果你使用的是HRP标记~建议要么更换防腐剂,要么延长洗膜时间和次数。其他防腐剂可以选择:硫柳汞钠、极少量的氯仿(1~2ul就可以)    Q4、和牛奶一样,只要不臭,就可以反复使用,而且,有的高手提议放的时间长一点,效果反而更好,也许是溶解的更为彻底的缘故吧。    Q5、都一样吧,在不加防腐剂的情况下,两者的保存时间都不久。我们实验室是牛奶+叠氮钠,虽然用的是HRP,但只要洗膜时间有保证,一般问题不大。加了防腐剂的牛奶可以用蛮长时间的,一个月应该没问题吧。还有一点就是,有的蛋白用会更好,有的蛋白则用牛奶会更好,这是我的个人经验,因为曾经用两种稀释液做过同一个样品同一个蛋白的western,结果证实牛奶的背景更干净,特异性更好,的则会有杂带。       F、 请问,我最近做了两次的免疫荧光,均失败,可基本排除是抗体问题,我想问问,其中免疫荧光中的封闭液(我用的是5%)跟我的一抗有关吗?封闭液的选择是否和一抗的稀释液需相同?    Q1、封闭液对一抗的结合影响不大,失败的原因不应该是封闭液的原因。一抗可以用封闭液稀释。我们做的经验看,相对组化中一抗的浓度,荧光的稀释比例应该大,即假如组化是1:100,荧光可以试1:50。     G、我的包被的蛋白是用偶联的二十四个多肽,我想问下我用什么做封闭液才行呢?    Q1、或是酪蛋白的封闭液都行,封闭是为了封闭抗原没有占据的空白点,跟你的多肽用何种蛋白偶联没有任何关系!      H、课题牵涉到ELISA检测血清中抗原,在网上看到封闭液的配方又很多种,由于经费有限,是否也可以效仿western blot 使用脱脂奶粉作配封闭液,或者能介绍一下又有效又实惠的配方?    Q1、脱脂奶粉做封闭液是相当得可以,另外廉价的封闭液有,酪蛋白等。都可以用来做封闭液。    Q2、放在瓶子里溶解,称量好干粉和其他的盐后,放到瓶子里使劲摇……让蛋白和盐结晶充分混合,再加水很快就溶了。


  • 裂解液的使用方法

    详细介绍: 裂解液的使用方法 RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组 DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子,例如NFκB、p53等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录因子 对于培养细胞样品: 1. 融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。 2.对于贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后,细胞就会被裂解。 对于悬浮细胞:离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成50-100万细胞/管,然后再裂解。 裂解液用量说明:通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。 对于组织样品: 1. 把组织剪切成细小的碎片。 2. 融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。 3. 按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。) 4. 用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。 5. 充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。 6. 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。


  • 封闭液的选择

    详细介绍:     固相载体表面(如ELISA板,NC膜或者PVDF膜上等)有很多洞洞,通过电转或包被,胶上的蛋白被转移到了膜上,或抗原/抗体固定在板上,蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多洞洞里面,但蛋白并不是连续的,有很多空隙,而且比如说样品孔之间也有空隙,这些洞洞并没有填进东西,而抗体也是蛋白,也会被吸附在空的洞里,这样,就会有很多非特异性的信号。封闭液中的蛋白可以与表面上的空白位置结合,同样以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上,因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异结合,所以有“封闭”的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。这样,抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上,而只会跟特异性蛋白结合。封闭剂应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白、不结合靶蛋白表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。    封闭所用试剂:    1、BSA    BSA是最常用的封闭剂,成分单一适用于大多数情况。若免疫原是偶联BSA的, BSA有很强的免疫原性,会导致产生很多的针对BSA的抗体,为避免交叉反应,不能用BSA、脱脂奶粉等封闭,可以选用酪蛋白或无蛋白的封闭剂封闭。    大部分BSA中有少量的抗体残留,会导致抗原/抗体之间的交叉反应,产生高背景,杂带较多或使得本底水平增高。    2、血清    封闭血清的原理主要有两点,第一是待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质,从而导致背景过高,因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合,从这点看,BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体,可以和抗体恒定区结合,与抗体特异性无关,封闭血清中有抗体,因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。    免疫组化中用血清封闭的较多。封闭血清一般选择和二抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合,否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合, 会造成背景。但要注意封闭用血清中不能含有目标蛋白,且与一抗来源不同。另外二抗因尽量少选取兔子或老鼠来源的,因为这两个在亲缘关系上和人类非常接近,所以产生交叉反应的机会就比较大,从而导致背景比较高。!适合选用来源于驴,山羊,绵羊等的二抗,背景相对就很低。    3、脱脂奶粉    脱脂奶粉最大的优点是价钱便宜,所以是首选,但是由于成分相对复杂,所以适用范围要狭窄一些。磷酸化抗体也许会导致背景增加,此外,因为自身含有生物素,不能用于生物素标记的抗体系统。    奶粉蛋白种类比BSA多,而WB膜也好,ELISA板也好,表面的微结构都不是那么均匀的,相对而言,不同分子量蛋白种类多的奶粉(BSA只是一种蛋白),封闭起来更全面。    脱脂奶粉中含有少量的生物素和碱性磷酸酶残留,在使用生物素-亲和素系统和碱性磷酸酶标记的二抗时,也会使得高背景或本底水平增高。由于奶粉的成份复杂,而且封闭后的载体不易长期保存,因此在raybet雷竞技下载地址的制备中较少应用。    4、酪蛋白    和BSA作用类似,普通酪蛋白不易溶解。中性和碱性条件下带有负电性,与同样带负电荷胶体金之间存在排斥力,而膜一般都是带正电荷,会与酪蛋白有一定的吸附作用,用酪蛋白封闭效果好些。    5、无蛋白化合物    甲醛:与PVDF膜表面的微结构反应或者结合,使之失去结合蛋白的疏水力或者空间结构域。    去污剂(吐温-20):有抗原修复的作用,与膜疏水性吸附,有很强的对非特异性吸附的洗脱作用,同样可以降低蛋白间的疏水作用,可提高特异性抗体的识别能力。


  • RIPA裂解液

    详细介绍: RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。 RIPA裂解液(强)的主要成分为50mM Tris(pH 7.4),150mM NaCl,1%TritonX-100,1% sodium deoxycholate,0.1% SDS,以及2mM sodium pyrophosphate,25mM β-glycerophosphate,1mM EDTA,1mM Na3VO4,0.5 ug/ml leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白降解。 RIPA裂解液(中)的主要成分为50mM Tris(pH 7.4),150mM NaCl,1% NP-40,0.5% sodium deoxycholate。 使用方法对于培养细胞样品: 1. 融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。 2.对于贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后,细胞就会被裂解。 对于悬浮细胞:离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成50-100万细胞/管,然后再裂解。 裂解液用量说明:通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。


  • ECL发光液使用说明

    详细介绍:    ECL发光液使用说明    注意事项:       1)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。       2)步骤1~5可在日光灯下操作;但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低,移到暗房操作可避免。戴手套可以避免在膜上留下手印,保持膜的干净。       3)长时间曝光或蛋白过量,将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊。       4)发光工作液孵育约3分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见,低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使X光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使X光胶片感光,因此弱带可曝光1-10小时。如果曝光后条带不佳,可用洗膜缓冲液洗膜,重新孵育二抗,然后重新用ECL发光和曝光。       5)由于发光液灵敏度高,抗体浓度过高将造成高背景或没有条带,导致失败,所以要适度优化抗体浓度。       6)某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光,应选择高质量保鲜膜。       7)避免将多张膜置于同一个洗膜盒内洗膜,相互吸附或摩擦可能造成很深的背景。       8)使用肉眼可见的预染色蛋白Marker和荧光-放射自显影曝光标签可精确确定胶片上条带的位置和大小。       9)使用生物素-亲和素系统,避免使用牛奶封闭,可能会导致背景过高。       10)金属氧化物颗粒可能会造成膜上出现颗粒状斑点,避免使用带有锈迹的剪刀以及镊子,建议使用塑料的平头镊子。       11)叠氮化钠(NaN3)能抑制HRP活性,若回收HRP标记探针或者抗体应避免使用NaN3,如必需使用勿超过0.01%。       12)本品无特殊毒性,按普通化学品处理。


  • 开发GAPDH抗体抗体制备新方法

    详细介绍:     开发GAPDH抗体抗体制备新方法    抗体能够通过与细菌和病毒结合直接抑制病原体的活性或者向免疫细胞发送信号来摧毁入侵者。后一种功能使得抗体成为一种对抗癌症和其他疾病的治疗武器。    但是并不是所有抗体都是一样的。由于抗体糖分子基团在结构上存在微小但非常重要的差别,两种攻击相同入侵者的抗体可能对免疫细胞的招募能力并不相同。    来自马里兰大学和洛克菲勒大学的研究人员曾经开发了一种方法对抗体的糖分子基团结构进行修饰,为生化学家获得具有相同糖分子基团的抗体开启了大门。    在最近一项新研究中,研究人员将该方法又推进了一步,他们进一步确定了哪些糖分子的组合可以增强或抑制抗体向免疫系统发送信号的能力。相关研究结果发表在国际学术期刊PNAS上。该研究为开发对抗癌症和其他疾病的高效抗体奠定了新的基础。    抗体发送杀伤信号的能力依赖于连接在抗体上的糖分子链的结构。对于天然抗体来说,这些糖分子链存在很多可变性,即使是目前用于疾病治疗的抗体,一个给定剂量的抗体中也包含许多变体,根据糖分子基团的不同进行区分。    虽然之前的方法试图区分开这些不同变体,收集最有效的一部分,但是这些方法都比较耗时且昂贵,并且不是百分百有效。该研究所使用的方法能够保证研究人员通过生化技术获得具有相同糖分子基团的抗体,每一种带糖分子基团的抗体都能进行独立检测观察是否能够增强或抑制免疫应答。    目前市场上多数抗体都是用于治疗癌症或自身免疫疾病。研究人员表示他们的方法可以通过直接对抗体进行修饰对市场上现有的抗体进行改进,而不需要在基因水平上进行操作。


  • RIPA裂解液操作方法

    详细介绍:     操作方法    1. 执行常规电泳、转膜、HRP标记抗体或者HRP标记核酸探针孵育、洗膜。    ECL发光液是HRP的显色底物,因此检测系统最终必须基于HRP酶标记抗体或者核酸探针。    2. 最后一次洗膜的同时,新鲜配制发光工作液:分别取等体积的A液和B液,混匀后,室温放置备用。    取A液和B液一定要用不同的枪头;另建议立即使用工作液,室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。    3. 用平头镊取出膜,搭在滤纸上沥干洗液,勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液(100~200μl发光工作液/cm2膜)中,与发光工作液充分接触。室温孵育3分钟,准备立即压片曝光。    时间过长不会增加灵敏度,有时还会导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应,使用过少的发光工作液不利反应进行,也会导致膜上条带曝光不均和明显降低灵敏度。为达节约目的可将膜剪小,但勿降低发光液使用比例。    4. 用平头镊子夹起膜,膜的下缘轻轻接触吸水纸,去除膜上多余的液体,留下少量工作液,不可让膜完全干燥。    5. 在X光胶片暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将印迹膜贴在保鲜膜上,将保鲜膜折起来完全包裹印迹膜,去除气泡和皱褶,可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内,蛋白带面向上。    6. 暗房内取一张X光胶片至于包裹的膜上,压片,分别曝光不同的时间,如数秒到数分钟,定影显影冲洗。【注】:曝光时间需根据曝光强度做相应的调整。若是背景过高,可使用两张X光胶片同时压片。    注意事项    1)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。    2)步骤1~5可在日光灯下操作;但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低,移到暗房操作可避免。戴手套可以避免在膜上留下手印,保持膜的干净。    3)长时间曝光或蛋白过量,将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊。    4)发光工作液孵育约3分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见,低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使X光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使X光胶片感光,因此弱带可曝光1-10小时。如果曝光后条带不佳,可用洗膜缓冲液洗膜,重新孵育二抗,然后重新用ECL发光和曝光。    5)由于发光液灵敏度高,强烈推荐大多数进口抗体起始浓度为一抗1:1000~1:4000,二抗1:2000~1:5000。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带,导致失败。    6)某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光,应选择高质量保鲜膜。    7)避免将多张膜置于同一个洗膜盒内洗膜,相互吸附或摩擦可能造成很深的背景。    8)使用肉眼可见的预染色蛋白Marker和荧光-放射自显影曝光标签可精确确定胶片上条带的位置和大小。    9)使用生物素-亲和素系统,避免使用牛奶封闭,可能会导致背景过高。    10)金属氧化物颗粒可能会造成膜上出现颗粒状斑点,避免使用带有锈迹的剪刀以及镊子,建议使用塑料的平头镊子。    11)叠氮化钠(NaN3)能抑制HRP活性,若回收HRP标记探针或者抗体应避免使用NaN3,如必需使用勿超过0.01%。    12)本品无特殊毒性,按普通化学品处理。